Mae dilyniannau genomig y mwyafrif o firysau wedi bod yn hysbys.Ymchwilwyr asid niwcleig sy'n segmentau byr o DNA sydd wedi'u cynllunio i groesi gyda segmentau DNA firaol cyflenwol neu RNA.Mae'r adwaith cadwyn polymeras (PCR) yn dechneg fwy effeithlon ar gyfer canfod firaol.Mae dulliau diagnostig trwybwn uchel wedi'u datblygu'n ddiweddar.
A. Techneg hybridization asid niwcleig
Mae hybrideiddio asid niwclëig, yn bennaf gan gynnwys blotio De (De) a blotio Gogleddol (Gogledd), yn dechneg newydd sy'n datblygu'n gyflym ym maes diagnostig firws.Sail resymegol yr assay hybridization yw defnyddio segmentau byr o DNA (a elwir yn “chwiliwr”) a gynlluniwyd i groesi gyda segmentau DNA firaol cyflenwol neu RNA.Trwy wresogi neu driniaeth alcalïaidd, mae DNA targed dwbl neu RNA yn cael eu gwahanu'n llinynnau sengl ac yna'n cael eu hansymudol ar gynhalydd solet.Ar ôl hynny, mae stiliwr yn cael ei ychwanegu a'i hybrideiddio â'r DNA targed neu RNA.Gan fod y stiliwr wedi'i labelu ag isotop neu niwclid anymbelydrol, gellir canfod y DNA targed neu'r RNA trwy awtoradiograffeg neu gan y system biotin-avidin .Gan fod y rhan fwyaf o genomau firaol wedi'u clonio a'u dilyniannu, gellir eu canfod gan ddefnyddio dilyniannau firws-benodol fel stilwyr yn y sbesimen.Ar hyn o bryd, mae'r dulliau hybrideiddio yn cynnwys: blot dot , hybrideiddio in situ mewn celloedd , blotio DNA (DNA) (blotio Deheuol) a blotio RNA (RNA) (blotio gogleddol).
Technoleg B.PCR
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, datblygwyd cyfres o dechnegau mwyhau asid niwclëig in vitro yn seiliedig ar PCR, i brofi firysau ansensitif neu ansensitif.Mae PCR yn ddull sy'n gallu syntheseiddio dilyniant DNA penodol trwy adwaith polymeras in vitro.Mae'r broses PCR yn cynnwys cylchred thermol o dri cham: dadnatureiddio, anelio, ac ymestyn Ar dymheredd uchel (93 ℃ ~ 95 ℃), mae'r DNA llinyn dwbl wedi'i wahanu'n ddau edefyn DNA sengl;yna ar dymheredd isel (37 ℃ ~ 60 ℃), dau preimiwr niwcleotid syntheseiddio anelio i'r segmentau DNA cyflenwol;tra ar y tymheredd priodol ar gyfer ensym Taq (72 ℃), mae synthesis cadwyni DNA newydd yn cychwyn o primer 3'end gan ddefnyddio DNA cyflenwol fel templedi a niwcleotidau sengl fel deunyddiau.Felly ar ôl pob cylchred, gellir mwyhau un gadwyn DNA yn ddwy gadwyn.Gan ailadrodd y broses hon, gellir defnyddio pob cadwyn DNA wedi'i syntheseiddio mewn un cylchred fel templed yn y cylch nesaf, ac mae nifer y cadwyni DNA yn cael ei dyblu ym mhob cylchred, sy'n golygu bod cynhyrchu PCR yn cael ei chwyddo mewn cyflymder log 2n.Ar ôl 25 i 30 o gylchoedd, mae cynhyrchu PCR yn cael ei nodi trwy electrofforesis, a gellir arsylwi'r cynhyrchion DNA penodol o dan olau UV (254nm).Er ei fantais o benodoldeb, sensitifrwydd, a hwylustod, mae PCR wedi'i fabwysiadu mewn diagnosis clinigol o lawer o heintiau firaol megis HCV, HIV, CMV, a HPV.Gan fod PCR yn sensitif iawn, gall ganfod DNA firws ar lefel fg, dylid cynnal y llawdriniaeth yn ofalus iawn er mwyn osgoi positif ffug.Yn ogystal, nid yw canlyniad positif mewn prawf asid niwclëig yn golygu bod firws heintus byw yn y sampl.
Gyda chymhwysiad eang o dechneg PCR, datblygir technegau a dulliau newydd yn seiliedig ar dechneg PCR at wahanol ddibenion prawf.Er enghraifft, gall y PCR meintiol amser real ganfod llwyth firaol;defnyddir PCR in situ i nodi haint firws mewn meinwe neu gelloedd;Gall y PCR nythu gynyddu penodoldeb PCR.Yn eu plith, mae PCR meintiol amser real wedi'i ddatblygu'n gyflymach.Mae llawer o dechnegau newydd, megis chwiliwr hydrolysis TaqMan, chwiliwr hybrideiddio, a stiliwr beacon moleciwlaidd, wedi'u cyfuno'n dechneg PCR meintiol amser real, a ddefnyddir yn helaeth mewn ymchwil glinigol.Ar wahân i nodi'r llwyth firaol yn hylif corff cleifion yn gywir, gellir defnyddio'r dull hwn hefyd i ganfod mutant sy'n goddef cyffuriau.Felly, mae PCR meintiol amser real yn cael ei gymhwyso'n bennaf mewn gwerthuso effaith iachaol a gwyliadwriaeth goddefgarwch cyffuriau.
C. Canfod trwybwn uchel o asidau niwclëig firaol
Er mwyn diwallu'r angen am ddiagnosis cyflym o glefydau heintus newydd, mae amrywiol ddulliau canfod trwybwn uchel, fel sglodion DNA (DNA), wedi'u sefydlu.Ar gyfer sglodion DNA, mae stilwyr penodol yn cael eu syntheseiddio a'u cysylltu â sglodion silicon bach mewn dwysedd uchel iawn i ffurfio micro-arae chwiliwr DNA (DNA) y gellir ei hybrideiddio â sampl.Gall y signal hybrideiddio gael ei ddelweddu gan ficrosgop confocal neu sganiwr laser a chael ei brosesu ymhellach gan y cyfrifiadur a gellir cael set ddata enfawr yn ymwneud â genynnau gwahanol.Mae dau fath o sglodyn DNA.Mae'r “sglodyn synthesis” fel a ganlyn: mae'r oligonucleotidau penodol yn cael eu syntheseiddio'n uniongyrchol ar y sglodion.Un arall yw sglodion pwll DNA.Mae'r genynnau wedi'u clonio neu'r cynhyrchion PCR wedi'u hargraffu'n drefnus ar y sleid.Mantais technoleg sglodion DNA yw canfod nifer enfawr o ddilyniannau DNA ar yr un pryd.Gall y fersiwn ddiweddaraf o sglodion canfod pathogen adnabod dros 1700 o firysau dynol ar unwaith.Datrysodd technoleg sglodion DNA broblemau dulliau hybrideiddio asid niwclëig traddodiadol ac mae ganddi gymwysiadau eang iawn mewn diagnosis firaol ac astudiaeth epidemiolegol.
Amser postio: Rhagfyr 23-2020